Молекулярная фотометрия и спектрофотометрия - OXFORDST.RU

Молекулярная фотометрия и спектрофотометрия

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

метод исследования и анализа в-в, основанный на измерении спектров поглощения в оптич. области электромагн. излучения. Иногда под С. понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагн. излучения), фотометрию и спектрометрию [как теорию и практику измерения соотв. интенсивности и длины волны (или частоты) электромагн. излучения]; на практике С. часто отождествляют с оптич. спектроскопией. По типам изучаемых систем С. обычно делят на молекулярную и атомную. Различают С. в ИК, видимой и УФ областях спектра (см. Инфракрасная спектроскопия, Ультрафиолетовая спектроскопия).

Применение С. в УФ и видимой областях спектра основано на поглощении электромагн. излучения соединениями, содержащими хромофорные (напр., С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН 3 , ОН, NH 2 и др.) группы (см. Цветность органических соединений>. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов s-, p-и n-орбиталей осн. состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: s : s*, n: s*, p : p* и n: p* (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления; см. также Молекулярные спектры). Переходы s : s* находятся в далекой УФ области, напр. у парафинов при

120 нм. Переходы n: s* наблюдаются в УФ области; напр., орг. соед., содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N, Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине волны ок. 200 нм. Линии, соответствующие переходам p : p*, напр., в спектрах гетероциклич. соединений проявляются в области ок. 250-300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n: p*, находятся в ближней УФ и видимой областях спектра; они характерны для соед., в молекулах к-рых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщ. альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны ок. 285 нм. Переходы типа n: p* часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.

Переходы типа p : p* могут сопровождаться переходом электрона с орбитали, локализованной гл. обр. на одной группе (напр., С=С), на орбиталь, локализованную на др. группе (напр., С=О). Такие переходы сопровождаются переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры наз. спектрами с переносом заряда. Последние характерны для разл. комплексов (напр., арома-тич. соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.

Для ионов переходных металлов и их комплексных соед. характерны переходы с участием d-электронов, а для РЗЭ и актиноидов-переходы с участием f-электронов. Соответствующие соед. в р-ре бывают интенсивно окрашенными, причем окраска (спектр поглощения) зависит от степени окисления катиона и устойчивости комплексного соединения. Поэтому С. широко используют при исследовании и анализе комплексных соед. металлов.

Изолированные, не взаимодействующие между собой хромофоры в молекуле поглощают независимо. В случае к.-л. взаимод. между ними аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул, можно определять структуру энергетич. уровней молекул или по известной схеме энергетич. уровней определять положение полос поглощения. Любому электронному состоянию молекул соответствует набор разл. колебат. уровней энергии. Колебат. структура полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах нек-рых р-ров, что дает возможность получать дополнит. информацию о взаимод. молекул. Спектрофотометрич. исследование спектров молекул в видимой и УФ областях позволяет установить вид электронных переходов и структуру молекул. При этом часто исследуют влияние разл. типов замещения в молекулах, изменения р-рителей, т-ры и др. физ.-хим. факторов.

В ИК области проявляются переходы между колебат. и вращат. уровнями (см. Колебательные спектры, Вращательные спектры).Среди частот колебаний молекул выделяют т. наз. характеристические, к-рые практически постоянны по величине и всегда проявляются в спектрах хим. соед., содержащих определенные функц. группы (вследствие чего эти частоты иногда называют групповыми; см. табл. на форзаце 2-го тома). Теория колебаний сложных молекул позволяет расчетным путем предсказать колебат. спектр соединений, т. е. определить частоты и интенсивности полос поглощения.

Колебат. спектры молекул чувствительны не только к изменению состава и структуры (т. е. симметрии) молекул, но и к изменению разл. физ. и хим. факторов, напр. изменению агрегатного состояния в-ва, т-ры, природы р-рителя, концентрации исследуемого в-ва в р-ре, разл. взаимод. между молекулами в-ва (ассоциация, полимеризация, образование водородной связи, комплексных соед., адсорбция и т. п.). Поэтому ИК спектры широко используют для исследования, качеств. и количеств. анализа разнообразных в-в.

В ближней ИК области (10000-4000 см -1 , или 1-2,5 мкм), где расположены обертоны и составные частоты осн. колебаний молекул, полосы поглощения имеют интенсивность в 10 2 -10 3 раз меньше, чем в средней ИК области (4000-200 см -1 ). Это упрощает подготовку образцов, т. к. толщина поглощающего слоя м. б. достаточно большой (до неск. мм и более). Эксперим. техника для работы в этой области относительно проста. Однако чувствительность и селективность определения отдельных соед. невелики. Тем не менее высокое отношение сигнал:шум (до 10 5 ) создает хорошие условия для количеств. анализа при содержании определяемого соед. ок. 1% и выше. Подобные анализы выполняются за 1 мин. В дальней ИК области (200-5 см -1 ) могут наблюдаться чисто вращат переходы.

Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется вероятностью соответствующего электронного (или колебательного) перехода. Для характеристики интенсивности полосы служит молярный коэф. поглощения e (см. Абсорбционная спектроскопия),определяемый, согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, как e = A/Cl, где А = = ЧlgT= Чlg(I/I 0 ), T-пропускание, I 0 и I-интенсивности соотв. падающего и прошедшего через в-во излучения, С-молярная концентрация в-ва, поглощающего излучение, l-толщина поглощающего слоя (кюветы), в см. Обычно e 5 , в ИК области e

Химическая энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия . Под ред. И. Л. Кнунянца . 1988 .

  • СПЕКТРОСКОПИЯ ОТРАЖЕНИЯ
  • СПИЛЛОВЕР

Смотреть что такое «СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ» в других словарях:

спектрофотометрия — спектрофотометрия … Орфографический словарь-справочник

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ — область физики и техники, объединяющая разделы спектрометрии, фотометрии и метрологии и разрабатывающая системы методов и приборов для количеств. измерений спектр. коэфф. поглощения, отражения, излучения, спектр. яркости как хар к сред, покрытий … Физическая энциклопедия

Спектрофотометрия — (абсорбционная) физико химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200 400 нм), видимой (400 760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость … Википедия

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ — раздел фотометрии, посвященный вопросам измерения интенсивности монохроматического света. Измерение осуществляется визуально или объективно (с помощью спектрофотометров) путем сравнения 2 потоков излучений, методы С. применяются для… … Геологическая энциклопедия

спектрофотометрия — раздел фотометрии, в котором изучаются при помощи спектрофотометров оптические (спектральные) характеристики тел их излучательная, погло щательцая и отражательная способности. Новый словарь иностранных слов. by EdwART, , 2009. спектрофотометрия… … Словарь иностранных слов русского языка

спектрофотометрия — spektrofotometrija statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Fotometrijos šaka, susijusi su terpių, dangų, paviršių ir spinduolių atspindžio, praleidimo, sugerties, energinio skaisčio spektrinių faktorių matavimu. atitikmenys:… … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas

спектрофотометрия — spektrofotometrija statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Spektroskopijos šaka, tirianti spektrus fotometrijos metodais. atitikmenys: angl. spectral photometry; spectrophotometry vok. Spektralphotometrie, f;… … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas

спектрофотометрия — spektrofotometrija statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Šviesos šaltinių spinduliavimo ir nuo įvairių kūnų atspindėtos spinduliuotės spektrų tyrimas spektrofotometru. atitikmenys: angl. spectral photometry;… … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas

спектрофотометрия — spektrofotometrija statusas T sritis chemija apibrėžtis Spektroskopijos šaka, tirianti spektrus fotometrijos metodais. atitikmenys: angl. spectrophotometry rus. спектрофотометрия … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas

спектрофотометрия — spektrofotometrija statusas T sritis fizika atitikmenys: angl. spectrophotometry vok. Spektralphotometrie, f; Spektrophotometrie, f rus. спектральная фотометрия, f; спектрофотометрия, f pranc. spectrophotométrie, f … Fizikos terminų žodynas

спектрофотометрия — (спектр + фотометрия) метод качественного и количественного анализа веществ, основанный на измерении их спектров поглощения или излучения; применяется в лабораторной практике … Большой медицинский словарь

Молекулярная фотометрия и спектрофотометрия

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ, метод исследования и анализа веществ, основанный на измерении спектров поглощения в оптический области электромагн. излучения. Иногда под СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагн. излучения), фотометрию и спектрометрию [как теорию и практику измерения соответственно интенсивности и длины волны (или частоты) электромагн. излучения]; на практике СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ часто отождествляют с оптический спектроскопией. По типам изучаемых систем СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ обычно делят на молекулярную и атомную. Различают СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ в ИК, видимой и УФ областях спектра (см. Инфракрасная спектроскопия, Ультрафиолетовая спектроскопия).

Применение СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ в УФ и видимой областях спектра основано на поглощении электромагн. излучения соединениями, содержащими хромофорные (например, С = С, С = С, С=О) и ауксохромные (ОСН 3 , ОН, N H 2 и др.) группы (см. Цветность органических соединений>. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов s -, p -и n-орбиталей основные состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: s : s *, n : s *, p : p * и n : p * (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления; см. также Молекулярные спектры). Переходы s : s * находятся в далекой УФ области, например у парафинов при

Читайте также  Машины и их основные элементы

120 нм. Переходы n : s * наблюдаются в УФ области; например, органическое соединение, содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N , Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине волны около 200 нм. Линии, соответствующие переходам p : p *, например, в спектрах гетероциклический соединений проявляются в области около 250-300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n : p *, находятся в ближней УФ и видимой областях спектра; они характерны для соединение, в молекулах которых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщ. альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны около 285 нм. Переходы типа n : p * часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.

Переходы типа p : p * могут сопровождаться переходом электрона с орбитали, локализованной главным образом на одной группе (например, С=С), на орбиталь, локализованную на др. группе (например, С=О). Такие переходы сопровождаются переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры называют спектрами с переносом заряда. Последние характерны для различные комплексов (например, арома-тич. соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.

Для ионов переходных металлов и их комплексных соединений характерны переходы с участием d-электронов, а для РЗЭ и актиноидов-переходы с участием f-электронов. Соответствующие соединение в растворе бывают интенсивно окрашенными, причем окраска (спектр поглощения) зависит от степени окисления катиона и устойчивости комплексного соединения. Поэтому СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ широко используют при исследовании и анализе комплексных соединений металлов.

Изолированные, не взаимодействующие между собой хромофоры в молекуле поглощают независимо. В случае к.-л. взаимодействие между ними аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул, можно определять структуру энергетич. уровней молекул или по известной схеме энергетич. уровней определять положение полос поглощения. Любому электронному состоянию молекул соответствует набор различные колебательное уровней энергии. Колебат. структура полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах некоторых растворов, что дает возможность получать дополнительной информацию о взаимодействие молекул. Спектрофотометрич. исследование спектров молекул в видимой и УФ областях позволяет установить вид электронных переходов и структуру молекул. При этом часто исследуют влияние различные типов замещения в молекулах, изменения растворителей, температуры и др. физических-химический факторов.

В ИК области проявляются переходы между колебательное и вращательное уровнями (см. Колебательные спектры, Вращательные спектры). Среди частот колебаний молекул выделяют так называемой характеристические, которые практически постоянны по величине и всегда проявляются в спектрах химический соединение, содержащих определенные функциональных группы (вследствие чего эти частоты иногда называют групповыми; см. табл. на форзаце 2-го тома). Теория колебаний сложных молекул позволяет расчетным путем предсказать колебательное спектр соединений, т. е. определить частоты и интенсивности полос поглощения.

Колебат. спектры молекул чувствительны не только к изменению состава и структуры (т.е. симметрии) молекул, но и к изменению различные физических и химический факторов, например изменению агрегатного состояния вещества, температуры, природы растворителя, концентрации исследуемого вещества в растворе, различные взаимодействие между молекулами вещества (ассоциация, полимеризация, образование водородной связи, комплексных соединений, адсорбция и т. п.). Поэтому ИК спектры широко используют для исследования, качеств. и количественное анализа разнообразных веществ.

В ближней ИК области (10000-4000 см -1 , или 1-2,5 мкм), где расположены обертоны и составные частоты основные колебаний молекул, полосы поглощения имеют интенсивность в 10 2 -10 3 раз меньше, чем в средней ИК области (4000-200 см -1 ). Это упрощает подготовку образцов, так как толщина поглощающего слоя может быть достаточно большой (до несколько мм и более). Эксперим. техника для работы в этой области относительно проста. Однако чувствительность и селективность определения отдельных соединений невелики. Тем не менее высокое отношение сигнал:шум (до 10 5 ) создает хорошие условия для количественное анализа при содержании определяемого соединения около 1% и выше. Подобные анализы выполняются за 1 мин. В дальней ИК области (200-5 см -1 ) могут наблюдаться чисто вращат переходы.

Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется вероятностью соответствующего электронного (или колебательного) перехода. Для характеристики интенсивности полосы служит молярный коэффициент поглощения e (см. Абсорбционная спектроскопия), определяемый, согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, как e = A/Cl, где А = = — lgT= — lg(I/I 0 ), T-пропускание, I 0 и I-интенсивности соответственно падающего и прошедшего через вещество излучения, С-молярная концентрация вещества, поглощающего излучение, l-толщина поглощающего слоя (кюветы), в см. Обычно e 5 , в ИК области e 3 (л/моль•см). Закон Бугера-Ламберта-Бера лежит в основе количественное анализа по спектрам поглощения.

Для измерения спектров используют спектральные приборы-спектрофотометры, основные части которого: источник излучения, диспергирующий элемент, кювета с исследуемым веществом, регистрирующее устройство. В качестве источников излучения применяют дейтериевую (или водородную) лампу (в УФ области) и вольфрамовую лампу накаливания или галогенную лампу (в видимой и ближней ИК областях). Приемниками излучения служат фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и фотоэлементы (фоторезисторы на основе PbS). Диспергирующими элементами прибора являются призмен-ный монохроматор или монохроматор с дифракц. решетками. Спектр получают в графич. форме, а в приборах со встроенной мини-ЭВМ-в графической и цифровой формах. Графически спектр регистрируют в координатах: длина волны (нм) и(или) волновое число (см -1 )-пропускание (%) и(или) оптический плотность. Осн. характеристики спектрофотометров: точность определения длины волны излучения и величины пропускания, разрешающая способность и светосила, время сканирования спектра. Мини-ЭВМ (или микропроцессоры) осуществляют автоматизир. управление прибором и различные мат. обработку получаемых эксперим. данных: статистич. обработку результатов измерений, логарифмирование величины пропускания, многократное дифференцирование спектра, интегрирование спектра по различные программам, разделение перекрывающихся полос, расчет концентраций отдельных компонентов и т. п. Спектрофотометры обычно снабжаются набором приставок для получения спектров отражения, работы с образцами при низких и высоких температурах, для измерения характеристик источников и приемников излучения и т.п.

Для исследования спектров в ИК области используют обычно спектрофотометры, работающие в интервале от 1,0 до 50 мкм (от 10000 до 200 см -1 ). Осн. источниками излучения в них являются стержень из кароида кремния (глобар), штифт из смеси оксидов циркония, тория и иттрия (штифт Нернста) и спираль из нихрома. Приемниками излучения служат термопары (термоэлементы), болометры, различные модели оптико-акустич. приборов и пироэлектрич. детекторы, например на основе дейтерированного триглицинсульфата (ТГС). В спектрофотометрах, сконструированных по «клас-сич.» схеме, в качестве диспергирующих элементов применяют призменный монохроматор или монохроматор с дифракц. решетками. С кон. 60-х гг. 20 в. выпускаются ИК фурье-спектрофотометры (см. Фурье-спектроскопия), которые обладают уникальными характеристиками: разрешающая способность-до 0,001 см -1 , точность определения волнового числа v-до 10 -4 см -1 (относит. точность b D v/v ! ! 10 -8 ), время сканирования спектра может достигать 1 с, отношение сигнал:шум превышает 10 5 . Эти приборы позволяют изучать образцы массой менее 1 нг. К ним также имеются различные приставки для получения спектров отражения, исследования газов при малых или высоких давлениях, разных температурах и т. п. Встроенная в прибор мини-ЭВМ управ ляет прибором, выполняет фурье-преобразования, осуществляет накопление спектров, проводит различные обработку получаемой информации.

ИК фурье-спектрофотометры могут содержать программы по автоматич. идентификации образца неизвестного состава и определению содержания примесей, например в полупроводниковых материалах.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ широко применяют для исследования органическое и неорганическое веществ, для качеств. и количественное анализа различных объектов (в частности, природных), для контроля технол. процессов. Так, разработаны спектрофотометрич. методы определения в растворах Сu и Rb (пределы обнаружения 3•10 -6 % по массе), Со (2,5 • 10 -5 % по массе), Hf и Zr (0,5 мкг/мл); V (0,2 мкг/мл), гликозидов (0,05 мкг), белков (0,2 мкг/мл), тимола (1-2 мкг/мл); в атмосфере можно определить СО, оксиды азота, этилен, О 3 , NH 3 , CH 4 с пределами обнаружения

Литература: Ельяшевич М. А., Атомная и молекулярная спектроскопия, М., 1962; Дайер Д. Р., Приложения абсорбционной спектроскопии органических соединений, пер. с англ., М., 1970; Приборы и методы анализа в ближней инфракрасной области, М., 1977; Смит А., Прикладная ИК-спектроскопия, пер. с англ., М., 1982; Современная колебательная спектроскопия неорганических соединений, Новосиб., 1990; Накамото К., ИК спектры и спектры КР неорганических и координационных соединений, пер. с англ., М., 1991. Э. Г. Тетерин.

Химическая энциклопедия. Том 4 >> К списку статей

Спектрофотометрия в биохимических исследованиях

Спектрофотометр измеряет пропускание света, т.е. снижение интенсив­ности падающего света I до интенсивности I при прохождении через кювету с раствором. Изменение интенсивности света связано с концентрацией анализируемого вещества в растворе законом Бугера-Ламберта-Бера:

I/I = e -εcd (1)

где d – длина оптического пути, ε – коэффициент поглощения, которая является константой для анализируемого вещества, с — концентрация анализируемого вещества. Интенсивность падающе­го света I определяется как общая интенсивность света и принимается за 100%. Экспоненциальная зависимость может быть преобразована в линейную форму, где отри­цательный логарифм пропускания заменен на поглощение А:

Читайте также  Игровая программа 15

A = — log(I/I ) = εcd

Область применения спектрофотометрических методов в химической или биохимической лаборатории довольно широка. На определении оптического поглощения основаны различные методы количественного анализа аминокислот, белков, коферментов, НАДФ, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и др. соединений. Большая часть методов ферментативного анализа также связано с из­мерением оптического поглощения. Кроме того, спектрофотометрия может быть использована для установления зависимости между спектрами поглощения различных соединений и их химическим строением, т.е. проведения не только количественного, но и качественного анализа. С помощью спектрофотометрии можно также проводить турбидиметрический анализ, т.е. проводить измерение света, прошедшего через суспензии, эмульсии и коллоидные растворы. В этом случае свет не поглощается, а преимущественно рассеивается, тем не менее уменьшение интенсивности света может быть определено на обычном спектрофотометре. Поэтому спектрофотометрия может быть также использована при анализе клеточных культур, жировых эмульсий, мицелл и других полимерных структур.

В спектрофотометрии выделяют две основные группы методов: абсорбционные методы, в которых количество вещества определяется из его собственного поглощения, и колориметрические методы, в которых используются дополнительны окрашивающие соединения, а интенсивность окраски анализируемого образца оценивают по калибровочной кривой для соответству­ющего красителя. Для осуществления всех этих методов могут быть использованы одни и те же инструменты.

Количественное определение белков

Измерение концентрации белка в жидких пробах является обычной процедурой во многих научных лабораториях. Точная количественная оценка имеет большое значение для всех экспериментов, связанных с белками во множестве научно-исследовательских тем в области биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии, биологии развития и генетике. Существуют различные методы для количественного определения белка, многие из которых основаны на измерении спектра поглощения белков или белковых комплексов при определённых значениях длин волн.

С помощью спектрофотометрических методов может быть проведено прямое определение белка путём измерения оптического поглощения при 280 нм, основанное на присутствии в составе белка остатков ароматических аминокислот тирозина и триптофана. Этот способ прост и требует очень небольшого объема образца. Кроме того, после измерения образец можно использовать вновь. В то же время чувствительность метода невысокая, измерению мешает присутствие любых веществ, погло­щающих в ультрафиолетовом диапазоне, в первую очередь остатков нуклеиновых кислот, чей пик поглощения на длине волны 260 нм в значительной степени перекрывает пик белков при 280 нм.

Для количественного и качественного определения белка используют также различные цветные реакции, основанные на взаимодействии определенных аминокислотных остатков с окрашивающими соединениями. К наиболее распространённым методам количественного определения белка относятся анализ на основе бицинхониновой кислоты, анализ методом Брэрдфорда и анализ методом Лоури.

Метод на основе бицинхониновой кислоты использует реакции окислениия ионов меди Cu 2+ до Cu + в щелочной среде под действием аминокислот и образование окрашенного комплекса между ионами Cu + и бицинхониновой кислотой, имеющего пик поглощения при длине волны 562 нм.

Аналитический метод Брэдфорда является одним из самых распространенных методов определения концентрации белка. Метод основан на образовании комплекса между красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 и белками в растворе. Кумасси связывается с главным образом с аргинином, триптофаном, тирозином, гистидином, фенилаланином. Образующиеся комплексы имеют оптическую плотность при 590—595 нм.

Метод Лоури также основан на окислении ионов меди Cu 2+ до Cu + в щелочной среде под действием аминокислот. Далее происходит реакция между ионами меди Cu + и реактивом Фолина с образованием молибденовой сини, имеющей максимум адсорбции при 500—800 нм.

Количественное определение белка: А) путём измерения абсорбции на длине волны 280 нм; Б) методом Брэдфорда; В) методом на основе бицинхониновой кислоты; Г) методом Лоури.

Эксперименты по количественному определению белка могут выполняться в кюветах, а также в микропланшетных ридерах, которые позволяют обрабатывать большое количество образцов за один промежуток времени. Недавно появилась статья, посвящённая применению многорежимных планшетных ридеров BMG Labtech для определения количества белка различными методами. Исследователями было проведено испытание приборов SPECTROstar Nano, FLUOstar Omega, PHERAstar FSX и CLARIOstar. Было проведено четыре эксперимента, основанных на описанных выше методах количественного определения белка. Для детекции использовался широко применяемый в лабораторной практике бычий сывороточный альбумин.

главная > справочник > химическая энциклопедия:

Спектрофотометрия

Спектрофотометрия, метод исследования и анализа веществ, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. Иногда под спектрофотометрией понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагнитного излучения), фотометрию и спектрометрию [как теорию и практику измерения соотв. интенсивности и длины волны (или частоты) электромагнитного излучения]; на практике спектрофотометрия часто отождествляют с оптической спектроскопией. По типам изучаемых систем спектрофотометрия обычно делят на молекулярную и атомную. Различают спектрофотометрия в ИК, видимой и УФ областях спектра (смотри Инфракрасная спектроскопия, Ультрафиолетовая спектроскопия).

Применение спектрофотометрии в УФ и видимой областях спектра основано на поглощении электромагнитного излучения соединениями, содержащими хромофорные (напр., С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН 3 , ОН, NH 2 и др.) группы (см. Цветность органических соединений). Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов s-, p-и n -орбиталей основного состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: s : s*, n : s*, p : p* и n : p* (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления;). Переходы s : s* находятся в далекой УФ области, например у парафинов при

120 нм. Переходы n : s* наблюдаются в УФ области; например, органических соединений, содержащие n -электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N, Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине волны около 200 нм. Линии, соответствующие переходам p : p*, например, в спектрах гетероциклических соединений проявляются в области около 250-300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n : p*, находятся в ближней УФ и видимой областях спектра; они характерны для соединений, в молекулах которых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщенных альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны около 285 нм. Переходы типа n : p* часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.

Переходы типа p : p* могут сопровождаться переходом электрона с орбитали, локализованной главным образом на одной группе (напр., С=С), на орбиталь, локализованную на др. группе (напр., С=О). Такие переходы сопровождаются переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры наз. спектрами с переносом заряда. Последние характерны для различных комплексов (например, ароматических соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.

Для ионов переходных металлов и их комплексных соединений характерны переходы с участием d -электронов, а для РЗЭ и актиноидов — переходы с участием f -электронов. Соответствующие соединения в растворе бывают интенсивно окрашенными, причем окраска (спектр поглощения) зависит от степени окисления катиона и устойчивости комплексного соединения. Поэтому спектрофотометрия широко используют при исследовании и анализе комплексных соединений металлов.

Изолированные, не взаимодействующие между собой хромофоры в молекуле поглощают независимо. В случае какого-либо взаимодействия между ними аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул, можно определять структуру энергетических уровней молекул или по известной схеме энергетических уровней определять положение полос поглощения. Любому электронному состоянию молекул соответствует набор различных колебательных уровней энергии. Колебательная структура полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах некоторых растворов, что дает возможность получать дополнительную информацию о взаимодействии молекул. Спектрофотометрическое исследование спектров молекул в видимой и УФ областях позволяет установить вид электронных переходов и структуру молекул. При этом часто исследуют влияние различных типов замещения в молекулах, изменения растворителей, температуры и др. физ.-хим. факторов.

В ИК области проявляются переходы между колебательными и вращательными уровнями (смотри Колебательные спектры, Вращательные спектры). Среди частот колебаний молекул выделяют так называемые характеристические, которые практически постоянны по величине и всегда проявляются в спектрах хим. соединений, содержащих определенные функциональные группы (вследствие чего эти частоты иногда называют групповыми). Теория колебаний сложных молекул позволяет расчетным путем предсказать колебательный спектр соединений, т. е. определить частоты и интенсивности полос поглощения.

Колебательные спектры молекул чувствительны не только к изменению состава и структуры (т.е. симметрии) молекул, но и к изменению различных физических и химических факторов, например изменению агрегатного состояния вещества, температуры, природы растворителя, концентрации исследуемого вещества в растворе, различные взаимодействия между молекулами вещества (ассоциация, полимеризация, образование водородной связи, комплексных соединений, адсорбция и т. п.). Поэтому ИК спектры широко используют для исследования, качественного и количественного анализа разнообразных веществ.

В ближней ИК области (10000-4000 см -1 , или 1-2,5 мкм), где расположены обертоны и составные частоты основных колебаний молекул, полосы поглощения имеют интенсивность в 10 2 -10 3 раз меньше, чем в средней ИК области (4000-200 см -1 ). Это упрощает подготовку образцов, так как толщина поглощающего слоя может быть достаточно большой (до нескольких мм и более). Экспериментальная техника для работы в этой области относительно проста. Однако чувствительность и селективность определения отдельных соединений невелики. Тем не менее высокое отношение сигнал:шум (до 10 5 ) создает хорошие условия для количеств. анализа при содержании определяемого соединений около 1% и выше. Подобные анализы выполняются за 1 мин. В дальней ИК области (200-5 см -1 ) могут наблюдаться чисто вращательные переходы.

Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется вероятностью соответствующего электронного (или колебательного) перехода. Для характеристики интенсивности полосы служит молярный коэффициент поглощения e, определяемый, согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, как e = A/Cl, где А = = — lg T= — lg( I / I 0 ), T -пропускание, I 0 и I -интенсивности соотв. падающего и прошедшего через вещество излучения, С -молярная концентрация вещества, поглощающего излучение, l -толщина поглощающего слоя (кюветы), в см. Обычно e 5 , в ИК области e 3 (л/моль•см). Закон Бугера-Ламберта-Бера лежит в основе количественного анализа по спектрам поглощения.

Для измерения спектров используют спектральные приборы-спектрофотометры, основные части которого: источник излучения, диспергирующий элемент, кювета с исследуемым веществом, регистрирующее устройство. В качестве источников излучения применяют дейтериевую (или водородную) лампу (в УФ области) и вольфрамовую лампу накаливания или галогенную лампу (в видимой и ближней ИК областях). Приемниками излучения служат фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и фотоэлементы (фоторезисторы на основе PbS). Диспергирующими элементами прибора являются призменный монохроматор или монохроматор с дифракционными решетками. Спектр получают в графической форме, а в приборах со встроенной мини-ЭВМ — в графической и цифровой формах. Графически спектр регистрируют в координатах: длина волны (нм) и(или) волновое число (см -1 )-пропускание (%) и(или) оптическая плотность. Основные характеристики спектрофотометров: точность определения длины волны излучения и величины пропускания, разрешающая способность и светосила, время сканирования спектра. Мини-ЭВМ (или микропроцессоры) осуществляют автоматизированное управление прибором и различную математическую обработку получаемых экспериментальных данных: статистическую обработку результатов измерений, логарифмирование величины пропускания, многократное дифференцирование спектра, интегрирование спектра по различным программам, разделение перекрывающихся полос, расчет концентраций отдельных компонентов и т. п. Спектрофотометры обычно снабжаются набором приставок для получения спектров отражения, работы с образцами при низких и высоких температурах, для измерения характеристик источников и приемников излучения и т.п.

Для исследования спектров в ИК области используют обычно спектрофотометры, работающие в интервале от 1,0 до 50 мкм (от 10000 до 200 см -1 ). Основными источниками излучения в них являются стержень из карбида кремния (глобар), штифт из смеси оксидов циркония, тория и иттрия (штифт Нернста) и спираль из нихрома. Приемниками излучения служат термопары (термоэлементы), болометры, различные модели оптико-акустических приборов и пироэлектрические детекторы, например на основе дейтерированного триглицинсульфата (ТГС). В спектрофотометрах, сконструированных по «классической» схеме, в качестве диспергирующих элементов применяют призменный монохроматор или монохроматор с дифракционными решетками. С кон. 60-х гг. 20 в. выпускаются ИК фурье-спектрофотометры, которые обладают уникальными характеристиками: разрешающая способность-до 0,001 см -1 , точность определения волнового числа v-до 10 -4 см -1 (относит. точность bDv/v ! ! 10 -8 ), время сканирования спектра может достигать 1 с, отношение сигнал:шум превышает 10 5 . Эти приборы позволяют изучать образцы массой менее 1 нг. К ним также имеются разл. приставки для получения спектров отражения, исследования газов при малых или высоких давлениях, разных температурах и т. п. Встроенная в прибор мини-ЭВМ управляет прибором, выполняет фурье-преобразования, осуществляет накопление спектров, проводит различную обработку получаемой информации.

ИК фурье-спектрофотометры могут содержать программы по автоматической идентификации образца неизвестного состава и определению содержания примесей, например в полупроводниковых материалах.

Спектрофотометрия широко применяют для исследования органических и неорганических веществ, для качественного и количественного анализа различных объектов (в частности, природных), для контроля технологических процессов. Так, разработаны спектрофотометрические методы определения в растворах Сu и Rb (пределы обнаружения 3•10 -6 % по массе), Со (2,5 • 10 -5 % по массе), Hf и Zr (0,5 мкг/мл); V (0,2 мкг/мл), гликозидов (0,05 мкг), белков (0,2 мкг/мл), тимола (1-2 мкг/мл); в атмосфере можно определить СО, оксиды азота, этилен, О 3 , NH 3 , CH 4 с пределами обнаружения

Лит.: Ельяшевич М. А., Атомная и молекулярная спектроскопия, М., 1962; Дайер Д. Р., Приложения абсорбционной спектроскопии органических соединений, пер. с англ., М., 1970; Приборы и методы анализа в ближней инфракрасной области, М., 1977; Смит А., Прикладная ИК-спектроскопия, пер. с англ., М., 1982; Современная колебательная спектроскопия неорганических соединений, Новосиб., 1990; Накамото К., ИК спектры и спектры КР неорганических и координационных соединений, пер. с англ., М., 1991. Э. Г. Тетерин.

IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум — 2017

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В АНАЛИЗЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

  • Авторы
  • Файлы работы
  • Сертификаты

Исследование любого пищевого продукта – сложная аналитическая задача из–за индивидуальности и многокомпонентности его состава. В связи с загрязнением окружающей среды одной из важнейших задач аналитической химии является определение малых содержаний следов тяжелых металлов, пестицидов, канцерогенов и т.д. Среди разнообразных физико–химических методов анализа широкое распространение получили фотометрические методы, которые используют для определения физико–химических показателей качества продовольственного сырья и готовых продуктов питания, их пищевой ценности и безопасности. Оптические методы используют для определения большинства химических элементов, сахаров, белков, витаминов, жиров, пектиновых веществ.

Фотометрический метод анализа – один из самых распространенных методов физико-химического анализа. Его распространению способствовали сравнительная простота необходимого оборудования, особенно для визуальных методов, высокая чувствительность и возможность применения для определения почти всех элементов периодической системы и большого количества органических веществ. Открытие новых реагентов, образующих окрашенные соединения с неорганическими ионами и органическими веществами, делает в настоящее время применение этого метода почти неограниченным.

Фотометрический метод анализа может применяться для большого диапазона определяемых концентраций. Его используют как для определения основных компонентов различных сложных технических объектов с содержанием до 20-30% определяемого компонента, так и для определения микропримесей в этих объектах при содержании их до 10 -3 – 10 -4 %. В фотометрических методах используют избирательное поглощение света молекулами анализируемого вещества. Согласно квантовой механике свет представляет собой поток частиц, называемых квантами или фотонами. Энергия каждого кванта определяется длиной волны излучения. В результате поглощения излучения молекула поглощающего вещества переходит из основного состояния с минимальной энергией в более высокое энергетическое состояние. Электронные переходы, вызванные поглощением строго определенных квантов световой энергии, характеризуются наличием строго определенных полос поглощения в электронных спектрах поглощающих молекул. Фотометрический метод включает визуальную фотометрию (колориметрию), фотоколориметрию и спектрофотометрию.

В основе количественного определения лежит закон Бугера – Ламберта – Бера, который устанавливает прямо пропорциональную зависимость между оптической плотностью и концентрацией вещества в исследуемом растворе [1]. Этапы количественного фотометрического анализа включают: перевод определяемого вещества в окрашенную форму; получение спектра поглощения исследуемого вещества и выбор спектральной области, соответствующей максимуму полосы поглощения определяемого компонента; получение зависимости оптической плотности раствора от концентрации вещества, взятого в качестве стандарта при длине волны λmax; определение концентрации вещества. Оптическую плотность растворов измеряют с помощью фотоколориметров и спектрофотометров. Измерение оптической плотности производят по отношению к раствору сравнения.

Фотометрический анализ используется в виноградарстве и виноделии для определения разнообразных органических соединений и минеральных элементов. Разработаны методики фотометрического определения фенолов в колбасных изделиях, белков в молочных продуктах, суммарного содержания сахаров в кондитерских изделиях, крахмала в муке и зерне, β-каротина в соках, кофеина в кофе и чае и др. [2].

Содержание ионов железа является одним из важнейших нормируемых показателей качества питьевых вод (ПДК не более 0,3 мг/дм 3 ), избыточные количества этих ионов придают неприятный вкус воде и при длительном ее употреблении могут вызвать серьёзные заболевания. Метод определения ионов железа основан на измерении светопоглощения интенсивно окрашенных в красно-фиолетовый цвет комплексных соединений железа с сульфосалициловой кислотой в кислой среде (рН = 1,8-2,5). В работе проведено экспериментальное определение содержания ионов железа (III) в водопроводной воде из разных районов г. Владикавказа с использованием фотоколориметра КФК-2. Оптическую плотность стандартных и исследуемых растворов измеряют при зеленом светофильтре и толщине слоя 1см относительно раствора сравнения. Показано, что все исследованные образцы питьевой воды соответствуют нормам качества, СанПин 2.1.4.10749-01.

Васильев В.Т. Аналитическая химия. В 2 кн. Кн. 2. Физико-химические методы анализа. – М.: Дрофа, 2005. – 383 с.

Коренман Я.И. Практикум по аналитической химии. Анализ пищевых продуктов: В 4-х кн. — Кн.2. Оптические методы анализа. – М.: КолосС, 2005. – 288 с.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: